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Universidad Internacional de las Américas Veritatem 2015, 1 (1), 15-38. diciembre 2015
Departamento de Investigación ISSN 2215-5317
https://revistas.uia.ac.cr/index.php/proveritatem/issue/view/2
Aceite esencial de clavo de olor, Syzygium aromaticum: Análisis de la actividad
microbiológica y farmacológica para el posible tratamiento contra la faringoamigdalitis
estreptocócica y lesiones causadas por el acné
Recepción: 15-11-2015
Aceptado: 15-12-2015
LICDA. MELISSA MARTÍNEZ DOMÍNGUEZ
LICDA. HAZEL MORALES MATAMOROS
LIC. CRISTHIAN XATRUCH GARCÍA
LIC. ADAM AMEY WILLIAMS
Universidad Internacional de las Américas
Resumen
En distintos campos, incluido el de salud, existe un número importante de usos reportados
para aceites esenciales de plantas y especias. El aceite esencial del fruto seco del clavo de olor,
Syzygium aromaticum, ha sido ampliamente estudiado y se le ha atribuido un importante efecto
sobre una amplia variedad de microorganismos que afectan a seres humanos. Este estudio pretendió
analizar la acción del aceite esencial extraído del fruto seco del clavo de olor sobre las bacterias
presentes en una lesión de acné como el Propionibacterium acnes y el Staphylococcus sub Hominis
y sobre el Streptococcus pyogenes presente en problemas como la faringoamigdalitis. Para esto se
extrajo el aceite esencial de los frutos secos del clavo de olor mediante una destilación por arrastre
en corriente de vapor, luego de determinar que es la técnica que brinda el mayor rendimiento en la
extracción. El aceite esencial extraído se caracterizó mediante pruebas de química líquida y análisis
instrumental mostrando al eugenol como principal componente. Se realizaron estudios de
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sensibilidad in vitro, de bacterias aisladas de una lesión activa de acné y del Streptococcus pyogenes
frente al aceite esencial extraído, observándose en ambos casos que los microorganismos fueron
sensibles. Es importante señalar que el Propionibacterium acnes no se pudo aislar, pero el aceite
esencial pudo ser evaluados en otras bacterias presentes en el acné. Se incorporó el aceite esencial
extraído a una formulación farmacéutica de uso tópico y se analizaron cualitativamente sus efectos
analgésico y antiinflamatorio en voluntarios con algún tipo de lesión en piel, lo que mostró un
resultado positivo importante.
Palabras claves: Syzygium aromaticum, Streptococcus pyogenes, Propionibacterium acnes,
analgésico, antiinflamatorio
Abstract
In several fields, including health, there is a significant number of reported uses for essential
oils of plants and spices. The essential oil of clove, Syzygium aromaticum, has been extensively
studied and has been credited with a major effect on a wide variety of organisms that affect humans.
This study aimed to analyze the action of the essential oil extracted from clove dried nut on the
bacteria in an acne lesion as Propionibacterium acnes and Staphylococcus sub hominis and
Streptococcus pyogenes which is present in problems such as pharyngitis. For this purpose, nuts
clove essential oil was extracted by steam distillation, after determining that this technique
provided the highest yield in the extraction. The extracted essential oil was characterized by liquid
chemical tests and instrumental analysis showing the eugenol as the major component. In vitro
sensitivity studies against the essential oil extracted were performed in bacteria isolated from an
active acne lesion and in Streptococcus pyogenes, in both cases it was observed that
microorganisms were sensitive. Importantly, the Propionibacterium acnes could not be isolated,
but the essential oil could be evaluated in other bacteria present in acne. The essential oil extracted
was incorporated to a pharmaceutical formulation for topical use and anti-inflammatory and
analgesic effects were qualitatively analyzed in volunteers with some type of skin lesion, which
showed a significant positive result.
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Keywords: Syzygium aromaticum, Streptococcus pyogenes, Propionibacterium acnés, analgesic,
anti-inflammatory
Introducción
Las lesiones cutáneas son muy
frecuentes en las personas, estas pueden tener
manifestaciones simples como laceraciones o
mostrarse más complicadas como
ulceraciones tipo celulitis.
El acné es una patología muy común en
adolescentes o en aquellas personas con algún
grado de alteración hormonal. Esta patología
además de ser molesta, por el grado de
inflamación que se puede presentar en cada
lesión, tiene una connotación anti-estética,
que tiende a generar en las personas la
necesidad de ocultar las lesiones, tratarlas
mediante procedimientos invasivos
mecánicos, o de consumir medicamentos
muy costosos, sin tener el conocimiento
muchas veces, que dicha patología es debida
a la presencia de un microorganismo en
particular, como es el Propionibacterium
acnes.
Cuando se presenta alguna lesión
cutánea el paciente necesita percibir analgesia
y efecto antiinflamatorio de una manera
rápida y eficaz. En ocasiones el uso de
algunos medicamentos disponibles
actualmente en el mercado está
imposibilitado, debido a la aparición de
reacciones adversas o al alto costo de los
medicamentos usados para este fin.
Chaverri C, Gätjens, Zavaleta, Chaverri
F., (2008) mencionan que la
faringoamigdalitis estreptocócica es una
enfermedad frecuente en la población
costarricense durante todo el año donde del
15% al 30% de los casos son en niños y de un
5% a un 10% de los casos son en adultos, esto
se manifiesta principalmente por la entrada de
la época lluviosa. Con la llegada de los
resfríos y la gripe se inician las infecciones de
las vías aéreas y con esto las sobreinfecciones
bacterianas de las amígdalas y la faringe.
El uso de tratamientos populares, a
partir de plantas medicinales, siempre ha sido
una fuente importante en el mantenimiento de
la salud humana durante toda su historia, de
tal forma que en la actualidad muchas
personas tienden a adquirir productos (que no
son reconocidos o que los distribuyen
empresas que no tienen en orden sus
controles) , con el propósito de mejorar su
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calidad de vida, por lo que el desarrollo y
diseño de productos basados en plantas que
muestran beneficios medicinales y que son
formulados con conocimientos técnicos y
científicos puede resultar positivo como
alternativa a la medicina tradicional.
Ante la situación recién expuesta, se
planteó analizar las propiedades terapéuticas
que pueda tener el aceite esencial extraído del
fruto seco del Syzygium aromaticum (clavo
de olor) al utilizarlo vía tópica como posible
alternativa en el tratamiento de lesiones
cutáneas mediante la formulación de una
crema y la elaboración de un antiséptico bucal
para tratar la faringoamigdalitis que tantas
incapacidades laborales y escolares produce
en las personas.
Actualmente puede encontrarse un
número importante de trabajos que resaltan
las propiedades tanto aromáticas como
farmacológicas del aceite esencial extraído de
los frutos secos del Syzygium aromaticum,
por ejemplo Debjit, Sampath, Akhilesh,
Shweta, Shravan y Amit (2012) mencionan
el uso en la India del aceite esencial del
Syzygium aromaticum en los frutos secos de
clavos de olor como especia, indican la
capacidad que posee el aceite esencial de
aumentar el flujo sanguíneo, aliviar síntomas
de reumatismo, lumbalgia y dolor dental.
Además, en este mismo artículo se menciona
el efecto antimicrobiano y el aumento de
secreción de ácido gástrico al ser ingerido.
En la India, Amin, Jassal y Tygi (2013)
destacan el efecto antioxidante que posee el
clavo de olor , debido a la presencia de
dieciséis compuestos volátiles, así como
también su actividad sobre la enzima MAO
(enzima monoamino oxidasa) con beneficios
ante patologías como el cáncer y el Alzheimer
tras su ingestión. De manera similar en este
estudio se mencionan los beneficios
farmacéuticos como agente carminativo y
analgésico.
Hakki, Murat, Nitz y Kollmannsberger
(2007) realizaron en Turquía un análisis sobre
la composición de los frutos de la planta
Syzygium aromaticum analizada por
cromatografía de gases con detector de
masas, donde se encontró que posee como
componente principal al eugenol en alrededor
de un 87%, seguido de 8% de isoeugenol y
3,56% de β-cariofileno, además destacan que
la composición del aceite esencial no presenta
mucha variación de sus componentes
principales según su procedencia geográfica,
también se menciona el uso del aceite
esencial de S. aromaticum en especialidades
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odontológicas, al mezclarlo con óxido de zinc
y utilizarlo como cemento o restauración
dental de uso temporal, así como su uso en
perfumería.
Apparecido, Sartoretto, Schmidt,
Caparroz, Bersani-Amado y Kenji (2009)
desarrollaron un estudio en ratas al inducir
edema en sus patas para analizar la capacidad
antiinflamatoria del aceite esencial de
Syzygium aromaticum tras su administración
parenteral y compararlo respecto de la
indometacina y celecoxib.
En el análisis se evaluó la capacidad
analgésica del eugenol contenido en el aceite
esencial, al compararlo respecto a la
meperidina como muestra control positiva y
agua como muestra control negativa donde se
obtuvo una respuesta muy similar respecto al
fármaco, sin embargo, el efecto analgésico
predominante se dio a nivel periférico, no
mostrando actividad analgésica ante dolor por
estimulación térmica.
En Iowa, Estados Unidos; Cai & Wu
(1996) procedieron a analizar la capacidad
antimicrobiana de distintos compuestos
aislados y extraídos de los clavos de olor de
la planta Syzygium aromaticum, donde se
logró determinar la concentración mínima
inhibitoria ante patógenos orales como el
Streptococcus mutans, Prevotella intermedia,
Porphyromonas gingivalis, y Actinomyces
viscosus.
En Madrid, Rojo, L., Barcenilla, J.,
Vázquez, B., González, R., & Román, J.
(2008), determinaron el efecto de producir
copolímeros de eugenol y su derivado de
etoxieugenol con 2-hidroxietilmetacrilato,
para determinar su efectividad
antimicrobiana ante dos patógenos orales
comunes, como lo son la Escherichia coli y
Streptococcus mutans, al variar las
proporciones de cada componente, mediante
pruebas de sensibilidad.
Según Janero & Makriyannis (2014), en
Boston se analizó la capacidad de unión de
varios terpenos y lípidos, a receptores de tipo
TRPA1, TRPV1, TRPV2 y TRPV3, para lo
cual el eugenol mostró que puede unirse y
desensibilizar el receptor transmembrana al
reducir la transmisión del dolor e inflamación
neurogénica donde también al igual que otras
sustancias fitoquímicas nombradas en el
estudio podrían ser utilizadas como
potenciales fármacos para indicaciones como
el dolor y el cáncer.
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En Alicante, España; Vianna (2011),
también indicó la actividad del eugenol sobre
los receptores TRP de tipo V1, V2 y A1,
presentes en el sistema trigeminal, al destacar
el beneficio de esta sustancia de origen
natural, sobre síntomas como el dolor,
inflamación, prurito; donde es comúnmente
utilizado en odontología en procesos bucales.
También en Costa Rica se han
reportado usos importantes para el aceite
esencial del clavo de olor. Por ejemplo,
Arévalo (2006), destaca el uso en agricultura
del eugenol, principal componente del aceite,
como eficiente insecticida para el control de
plagas.
Además, Arguedas (2014), menciona
como en Costa Rica se le da uso amplio al
eugenol en odontología como potente
analgésico dental, antiinflamatorio y
antibacteriano, donde generalmente se
mezcla con óxido de zinc para formar un
cemento temporal.
Tomando en cuenta todo lo anterior se
plantearon los siguientes objetivos para la
realización del estudio:
Determinar la técnica de extracción,
entre destilación por arrastre en corriente de
vapor o extracción continua empleando el
equipo soxhlet, que brinde el mejor
rendimiento experimental.
Verificar mediante análisis
espectroscópico y cromatografía de gases que
el componente principal del aceite esencial de
Syzygium aromaticum corresponde al
eugenol.
Determinar la posible actividad del
aceite esencial de clavo de olor frente a las
bacterias presentes en el acné como
Propionibacterium acnes y frente al
Streptococcus pyogenes que se encuentra en
las faringoamigdalitis, mediante una prueba
de sensibilidad de antibióticos.
Formular un preparado de uso tópico y
un enjuague bucal a partir del aceite esencial
de Syzygium aromaticum obtenido.
Analizar cualitativamente en
voluntarios, las propiedades terapéuticas,
antiinflamatorias y analgésicas, de un
preparado farmacéutico de uso tópico a partir
del aceite esencial extraído de los frutos secos
de la planta Syzygium romaticum.
De estos objetivos surge la pregunta
¿Es posible que el aceite esencial de Syzygium
21
aromaticum presente actividad terapéutica
contra el Propionibacterium acnes, el
Streptococcus pyogenes y contra otros
patógenos presentes en el acné o la
faringoamigdalitis al evaluarlo en voluntarios
y según las pruebas microbiológicas?
En los últimos años, ha aumentado el
interés de las personas, por el cuidado de la
piel, lo que ha aumentado el uso de productos
dérmicos que reparen los daños que se
presenten o que favorezcan que la curación y
sanación sean lo más pronto posible.
Sin embargo, las lesiones cutáneas son
muy comunes en las personas, las cuales
tienden a ser muy molestas, principalmente
porque sin importar el tamaño que posea la
lesión, producen dolor con mucho prurito,
inflamación y algunas veces pueden
infectarse con algún microorganismo. Para
este tipo de afecciones se utilizan
medicamentos antiinflamatorios derivados
frecuentemente de la familia de los
analgésicos antiinflamatorios no esteroideos
y los analgésicos antiinflamatorios
esteroideos, donde algunas veces se asocian a
antibióticos de uso tópico.
Actualmente en la sociedad existe
preferencia por remedios caseros que
implican el uso de plantas medicinales,
muchas veces por motivos económicos o por
la simple preferencia de usar solo productos
“naturales”.
Por dicha razón, los autores de esta
investigación diseñaron un producto de uso
tópico, desarrollado a partir de un extracto de
los frutos secos de los clavos de olor de la
planta Syzygium aromaticum, el cual
permitiría tratar síntomas comunes en las
afecciones tópicas, como el dolor y la
inflamación, además de prevenir o tratar
posibles infecciones de la zona dañada y
servir como posible componente innovador
en el tratamiento del acné, debido a las
diversas propiedades terapéuticas del
componente mayoritario del aceite esencial
de la planta.
Además, la investigación busca dar una
ayuda al tratamiento de las afecciones
faríngeas como la faringoamigdalitis,
mediante la elaboración de un enjuague
bucofaríngeo o colutorio a partir de los frutos
secos del Syzygium aromaticum con actividad
antibacteriana.
Con esto se generaría un beneficio a los
pacientes, médicos y farmacéuticos, ante
situaciones que ocurren a diario, además de
22
proporcionar una alternativa que puede
resultar atractiva para las personas, por su
procedencia directa de una planta, que aporta
un efecto terapéutico importante para el
paciente.
Metodología
El material vegetal utilizado fue
obtenido por compra directa en el mercado de
Heredia. El clavo de olor es desde Indonesia,
uno de los principales lugares del mundo
donde la planta Syzygium aromaticum crece
como en su hábitat natural.
Obtención del aceite esencial del Syzygium
aromaticum
Destilación del aceite.
100 g del fruto seco del clavo de olor,
pesados en balanza granataria, se colocaron
en un balón de destilación de 500 mL y se
cubrieron completamente con agua destilada
(unos 500 mL). La boca del balón se cubrió
con papel parafina y el material vegetal se
dejó macerar por 24 horas, al cabo de las
cuales el balón se adaptó a un sistema para
destilación de arrastre en corriente de vapor y
se obtuvieron aproximadamente 500 mL de
destilado. El destilado se mostró como una
mezcla heterogénea de aspecto lechoso y con
un fuerte aroma a clavo de olor.
Separación del aceite del destilado y
secado.
Se trasvasaron 100 mL del destilado
obtenido a un embudo de decantación y se le
adicionaron 25 mL de diclorometano,
momento en que se observó la separación de
dos fases, estas se mezclaron y se separaron.
La fase inorgánica superior correspondió al
agua mientras que la inferior correspondió a
la orgánica en la cual se encontraba el aceite
esencial requerido. La fase orgánica se
recogió en un erlenmeyer para su secado
posterior. Este procedimiento se repitió para
cada 100mL de destilado restante.
Todas las extracciones realizadas con
el diclorometano se reunieron para obtener
una fase orgánica que se secó con sulfato de
sodio anhidro. Para esto se adicionaron
pequeñas cantidades de este desecante
seguido de agitación y reposo hasta que no se
observara aglutinación del nuevo sólido
adicionado, lo que indicó el secado de la fase.
El sólido sedimentado se separó mediante
filtración por gravedad a través de papel de
filtro empleando un embudo de espiga. El
diclorometano se separó del aceite por
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destilación en un evaporador giratorio
(rotavapor) a una temperatura de 40°C.
Caracterización de los componentes del
aceite
Prueba de insaturaciones con bromo
disuelto en tetracloruro de carbono
(Br
2
/CCl
4
).
Dentro de un tubo de ensayo se
disolvieron 2 gotas del aceite esencial
obtenido en 2 mL de diclorometano, a la
disolución resultante se le adicionaron 3 gotas
de la disolución de Br
2
observándose la
decoloración inmediata de este reactivo, lo
que representó un resultado positivo para la
presencia de insaturaciones.
Prueba para fenoles con cloruro de hierro
(III).
Dentro de un tubo de ensayo se
disolvieron 2 gotas del aceite esencial en 2
mL de etanol, a la disolución resultante se le
adicionaron 3 gotas del cloruro de hierro (III)
observándose la rápida aparición de un color
verde-azulado, indicando la presencia de
grupos fenólicos en el aceite.
Espectro de infrarrojo del aceite.
Para el análisis por espectroscopía de
infrarrojo se empleó el espectrofotómetro de
infrarrojo Agilent Technologies Cary 630
FTIR Modelo G8044AA, para la obtención
de los espectros de infrarrojo tanto del aceite
esencial extraído como el de una muestra de
referencia de eugenol de marca Merck ® con
una pureza del 99,0 %, lo que mostró la
presencia de grupos funcionales presentes en
el eugenol.
Espectro de resonancia magnética nuclear
de hidrógeno.
Para el análisis por resonancia
magnética nuclear los espectros fueron
realizados y facilitados por el Laboratorio
Aduanero del Ministerio de Hacienda, en los
que se evidenció la presencia del eugenol.
Método para la siembra e identificación
de microorganismos presentes en una
pústula de acné
De un voluntario, que padecía
activamente de acné y tomando todas las
medidas estériles, se extrajo una muestra del
componente de una de las pústulas de acné.
Con esta muestra se realizó una inoculación
en el medio de cultivo TSA (Tripticasa-soya)
y las 3 placas correspondientes se
24
almacenaron por 7 días en condiciones de
almacenamiento, observando el crecimiento
microbiano trascurrido este tiempo.
La identificación de las bacterias
presentes en la pústula de acné del voluntario
se realizó en los laboratorios LABIN S.A.
mediante el equipo analizador automatizado
de BioMérieux-Francia, modelo Vitek 2
Compact. Para esta prueba, se proporcionó a
la empresa, el cultivo realizado en la placa de
TSA.
Método para la evaluación de la
capacidad antimicrobiana del aceite
esencial de clavo de olor frente a los
microorganismos presentes en la pústula
de acné mediante un antibiograma
Con los cultivos de microorganismos
de la lesión de acné se realizó el antibiograma
y se evaluó la acción del aceite esencial.
De las colonias obtenidas en los medios
de TSA, se seleccionó una colonia de
bacterias, pequeña y se inoculó en un medio
Mueller-Hinton y se colocaron varios discos
de papel filtro preparados con dos gotas de
aceite esencial de clavo de olor a cada uno,
los que se identificaron y almacenaron por 5
días, al término de los cuales, se midieron los
halos de inhibición mostrando resultados
importantes.
Formulación de una crema a partir del
aceite esencial de clavo de olor obtén
A partir del aceite esencial obtenido por
destilación de arrastre por vapor de los clavos
de olor, se formuló una crema al 2% de aceite
esencial.
Tabla 1. Fórmula para 100 gramos de crema de aceite esencial de clavo de olor
Fase
Ingrediente
Cantidad para cada 100g
I
Lanette N
22,0
Aceite mineral
6,0
Propilenglicol
4,0
25
II
Agua para el 100%
Csp
Metilparabeno
0,15
Propilparabeno
0,05
Glicerina
5,8
III
Aceite esencial de clavo de olor
2,0
Nota: Elaboración propia
Se mezclaron los componentes de la
fase I, y se calentaron a 70ºC con agitación
moderada y constante, de manera semejante
se mezclaron los componentes de la fase II.
Una vez alcanzada la temperatura de 70°C en
ambas mezclas, se vertió la fase II sobre la
fase I lentamente y con agitación constante,
una vez concluida la mezcla de las fases I y II
y manteniendo la agitación se añadió la fase
III hasta que se logró la homogeneidad y
consistencia deseada.
Prueba sobre lesiones de acné in vivo al
utilizar la crema formulada a base de
aceite esencial al 2%
Sobre una pústula de acné, en un
voluntario, se colocó la crema formulada con
el aceite esencial extraído de los frutos secos
de Syzygium aromaticum una vez al día
durante al menos 3 días, lo que mostró
resultados satisfactorios para el paciente.
Evaluación de la capacidad
antiinflamatoria de una crema de aceite
esencial de clavo de olor al 2%
A un voluntario que presentaba un tipo
de lesión con inflamación en piel producto de
una caída, se le aplicó la crema durante al
menos 3 días y se evaluó la actividad
terapéutica antiinflamatoria. Se observó una
disminución gradual de la inflamación a
medida que pasaron los días.
Evaluación de la capacidad analgésica de
una crema de aceite esencial de clavo de
olor al 2%
La capacidad analgésica del preparado
tópico de aceite esencial de los frutos secos de
clavo de olor al 2% se estudió en tres
voluntarios con algún tipo de lesión en piel, a
estos se les aplicó la crema y mediante
consulta directa, se determinó la cantidad de
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dolor que presentaba el paciente después de
15 minutos de la aplicación. Se usó una escala
de 0 a 10, donde 10 es mucho dolor y 0 sin
dolor. Los pacientes manifestaron una
disminución significativa del dolor.
Formulación de un enjuague bucal con
base de aceite esencial de clavo de olor
obtenido previamente
En un beaker se adicionaron 4,5 g de
laurilsulfato de sodio, 22,05 g de glicerina,
6,75 g de sorbitol y 4,8 g de sabor a menta, la
mezcla resultante se agitó magnéticamente
hasta lograr la disolución completa de todos
los componentes lo que se tardó unos 30 min.
Luego se adicionaron 15 mL de alcohol y 1,9
mL del aceite esencial del fruto seco de clavo
de olor. Se agregaron poco a poco 3/4 partes
del agua total de la formulación,
aproximadamente 90 mL. Por último, se
incorporó 0,048 g de sacarina sódica y una
gota de colorante azul y se agitó por 10
minutos, se completó la formulación con el
resto del agua hasta obtener un volumen de
120 mL.
Se prepararon 3 enjuagues bucales, uno
con el aceite esencial, uno con el principio
activo de eugenol y otro sin el aceite esencial
o el principio activo para realizar las pruebas
microbiológicas con las formas farmacéuticas
preparadas.
Método para la evaluación de la capacidad
antimicrobiana del aceite esencial de clavo
de olor, eugenol y colutorio sin principio
activo frente a una cepa de Streptococcus
pyogenes mediante un antibiograma
Con los cultivos de Streptococcus
pyogenes se realizó el antibiograma y se
evaluó la acción del aceite esencial, eugenol
y del colutorio sin el principio activo
observando resultados de sensibilidad para
los dos primeros.
De las colonias obtenidas en los
medios, se inoculó una placa de agar BHIA
con un hisopo y se colocaron varios discos de
papel filtro impregnados con 25 mL de las
tres muestras de enjuagues bucales. Se
incubaron las placas por 24 horas y pasado
este tiempo se midieron los halos formados.
Resultados y Discusión
Obtención del aceite esencial del clavo
(Syzygium aromaticum)
Con el fin de determinar el mejor
proceso para la extracción del aceite esencial,
27
se evaluaron las técnicas de arrastre en
corriente de vapor y extracción continúa
empleando el método soxhlet con etanol
como disolvente. En ambos casos se
emplearon cantidades iguales del material
vegetal de partida, observándose un mayor
porcentaje de extracción para el arrastre en
corriente de vapor por lo que fue la técnica
seleccionada. Los resultados de esta
evaluación se mostraron en la tabla 1.
Tablas 2. Porcentajes de extracción resultantes de las dos técnicas evaluadas en la obtención
del aceite esencial de clavo de olor (Syzygium aromaticum)
Técnica
Masa de partida del
material vegetal / g
Arrastre en corriente de vapor
50,0
Soxhlet
50.0
Nota: Elaboración propia
Los resultados de esta evaluación son
consistentes con lo indicado por Jiang et al
(2010) citado por Aguilar y López (2013), los
que afirman que los rendimientos a través del
arrastre en corriente de vapor, para la
obtención del aceite esencial de los frutos
secos de Syzygium aromaticum, son
superiores a los observados empleando
extracciones con un sistema de destilación
soxhlet.
Adicionalmente el método
seleccionado presenta la ventaja de extraer
principalmente los componentes volátiles,
dentro de los que se encuentra de forma
mayoritaria el eugenol (Apparecido, 2009).
Cabe destacar que las dos técnicas evaluadas
produjeron un líquido oleoso de tonalidad
amarillenta y con un fuerte aroma
característico del clavo de olor.
Caracterización de los componentes del
aceite esencial de clavo de olor extraído
Debido a que los principales
componentes del aceite corresponden a los
fenilpropanos eugenol y acetato de eugenilo,
se realizaron pruebas químicas para la
identificación de grupos funcionales
específicos presentes en sus estructuras. La
primera prueba fue para evidenciar el doble
enlace (C=C) de la cadena lateral presente en
28
ambos compuestos. Para esto se empleó una
disolución de bromo disuelto en tetracloruro
de carbono (Br
2
/ CCl
4
), comúnmente
utilizado para identificar insaturaciones. Esta
prueba mostró una decoloración inmediata
del reactivo de bromo, lo que corresponde a
un resultado positivo de acuerdo a lo esperado
de la adición de este reactivo al doble enlace,
obsérvese la Figura 1.
Figura 1. a) Bromación del eugenol (1) y b) bromación del acetato de eugenilo (2)
a)
(1)
b)
(2)
Nota: Elaboración propia
El grupo fenol del eugenol se evidenció
por reacción del aceite con una solución de
cloruro de hierro (III), observándose una
coloración azul-verdosa lo que es un
resultado positivo para este grupo funcional.
En esta prueba el ion férrico forma quelatos
con los compuestos fenólicos que actúan
como ligandos.
Adicionalmente, se verificó la
presencia de los principales grupos
funcionales del eugenol y acetato de eugenilo
mediante análisis espectroscópico. El
espectro de infrarrojo (Figura 2) evidenció
señales para grupos funcionales presentes en
ambos compuestos como una señal a 3082
cm
-1
asignada a la vibración de tensión C-H
aromático y señales a 1612 cm
-1
y 1514 cm
-1
para la tensión C=C del mismo grupo, además
de una señal a 1641 cm
-1
para la tensión C=C
del alqueno. El análisis de infarrojo también
mostró señales que diferencian a estos
compuestos, por ejemplo, se observó a 3518
cm
-1
la señal de tensión O-H para el eugenol,
y una señal débil a 1712 cm
-1
asignada a la
29
vibración del grupo C=O del acetato de
eugenilo.
Figura 2. Espectro de infrarrojo del aceite extraído
Nota: Elaboración propia
Por su parte el análisis por resonancia
magnética nuclear de hidrógeno (
1
H-RMN),
mostrado en la Figura 2, del aceite esencial
extraído de los frutos secos indicó señales de
un doblete a 3,6 ppm asignada al metileno (-
CH
2
) de la cadena lateral del benceno, un
singulete a 4,2 ppm para los protones del
grupo metoxi (-O-CH
3
), señales de 5,0 ppm
a 5,5 ppm para los protones sobre el
alqueno de la cadena lateral (H-C=CH
2
) y
señales típicas para los protones aromáticos
en la región de 7,0 ppm a 7,4 ppm. Todas
estas señales son consistentes con la
estructura del eugenol.
No se evidenció el acetato de eugenilo
en el espectro de
1
H-RMN puesto que estuvo
ausente la señal de singulete alrededor de 2,4
ppm típica para los protones alfa al carbonilo.
Esto puede deberse a la baja proporción de
este componente en el extracto, lo que se
comprobó mediante análisis de cromatografía
de gases que lo mostró en un 8,3 % frente a
un 88,1 % del eugenol.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumber (cm-1)
Transmitance
40 60 80 100
30
Figura 3. Espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (
1
H-RMN) del aceite
extraído
O-CH
3
H3, H5, H6
H3’ H1’
H2’
Nota: Elaboración propia
Análisis de sensibilidad de las bacterias
presentes en una lesión activa de acné y de
Streptococcus pyogenes frente al aceite
esencial del clavo de olor
Análisis microbiológico para
bacterias presentes en una lesión de acné.
Para evaluar la actividad del aceite
esencial, mediante una prueba de sensibilidad
de las bacterias frente a él, se requirió primero
de la obtención de microorganismos
presentes en la lesión activa de acné de un
voluntario. Para esto se realizó la siembra
respectiva sobre placas con medio de cultivo
Tripticasa-soya o placas TSA, lo que permitió
observar luego de 7 días el crecimiento
microbiano.
Una vez que se contó con los
microorganismos sobre las placas el siguiente
paso fue el análisis para su identificación. El
14 12 10 8 6 4 2 0 PPM
31
resultado del análisis por parte de la empresa
contratada, laboratorio LABIN S.A. en el
analizador automatizado de bioMérieux-
Francia Vitek 2 Compact, mostró que se
lograron aislar 4 bacterias distintas. Dos
cocos Gram positivos, que debido a un nivel
bajo de reactividad no se pudieron identificar;
otro coco Gram positivo (Staphylococcus
sub. Hominis) y un bacilo Gram positivo que
no fue identificable mediante el sistema Vitek
2 Compact. Estas bacterias se obtuvieron de
la pústula de acné del voluntario, cabe
destacar que el S. hominis es un
microorganismo que se puede encontrar
como flora natural de la piel y que
probablemente esté contribuyendo a
complicar el acné en el voluntario. De forma
adicional, un resultado sobresaliente del
análisis es que se no evidenció la presencia
del Propionibacteriun acnes, que
correspondió a uno de los microorganismos
de interés para la investigación.
Es importante resaltar que el cultivo se
realizó en presencia de oxígeno lo que pudo
ser un factor determinante en el hecho que no
se detectara el Propionibacteriun acnes, ya
que esta bacteria además de ser de
crecimiento lento es anaerobia. Este aspecto
se consideró durante el estudio; sin embargo,
la ausencia del equipo necesario para el
cultivo anaerobio fue una limitación para
verificar el crecimiento de la
Propionibacteriun acnes.
En el análisis de sensibilidad de los
microorganismos presentes en la muestra de
la lesión activa del acné tomada del
voluntario, se observó, luego de 5 días, el
desarrollo de halos de inhibición microbiana
en los medios de cultivo Mueller-Hinton, al
colocar discos impregnados con el aceite
esencial extraído.
Con estos resultados se logró demostrar
la potente actividad del aceite esencial de
clavo de olor ante microorganismos presentes
en la lesión de acné, donde, aunque no se
logró aislar al P. acnes, si se encontró la
inhibición contra el resto de microorganismos
presentes, como el ya identificado
Staphylococcus hominis, comúnmente
presente en la flora bacteriana natural de la
piel. Dicha bacteria puede contribuir a la
producción de sustancias irritantes como los
ácidos grasos, los cuales se manifiestan en el
acné.
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Tabla 3. Medida obtenida de los halos de inhibición formados en los medios de cultivo
Mueller-Hinton con los discos impregnados con el aceite esencial de Syzygium aromaticum
Disco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Promedio
Medida del halo de
inhibición (± 0,5 mm)
16
15
15
15
15
18
16
18
15
16
Nota: Elaboración propia
A partir de la tabla 3, se obtuvo una
medida promedio de 16,0 mm del halo de
inhibición alrededor de los discos
impregnados con el aceite esencial extraído
del fruto seco de clavo de olor. Por lo que se
puede afirmar que las bacterias obtenidas de
las lesiones de acné, presentan sensibilidad
ante el aceite esencial extraído de los frutos
secos de la planta Syzygium aromaticum.
Análisis microbiológico para el
Streptococcus pyogenes
El estudio microbiológico se basó en el
método de difusión conocido como el método
de Bauer Kirby, donde se categorizó los
microrganismos como resistentes cuando su
halo de inhibición es de 6 mm, intermedio
para un halo de 6 mm a 9 mm y susceptible
para un halo de inhibición mayor a 9 mm para
cada antibiograma. Se evaluaron las tres
preparaciones de enjuague bucal obteniendo
los siguientes resultados.
Tabla 4. Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial del fruto seco de clavo
de olor y eugenol
Muestra
Halo de inhibición / mm
Resultado
Aceite esencial de clavo de olor
15 mm
Positivo
33
Eugenol
16 mm
Positivo
Enjuague con aceite esencial de clavo de olor
11 mm
Positivo
Enjuague con eugenol
12 mm
Positivo
Enjuague sin principio activo
6 mm
Negativo
Nota: Elaboración propia
Con estos resultados se puede apreciar
que todas las muestras que contienen eugenol
o el aceite esencial producen un halo de
inhibición para el Streptococcus pyogenes.
Los resultados obtenidos son
congruentes con lo que se indica en la
literatura, ya que se observó el efecto
antibacteriano del aceite esencial de los frutos
secos de clavo de olor Syzygium aromaticum
frente a las bacterias Streptococcus pyogenes
y Staphylococcus hominis, entre otros, donde
se determinó que tanto el aceite esencial
como el eugenol extraído de él, así como las
formulaciones a base de estos inhiben el
crecimiento in vitro de la bacteria.
Análisis farmacológicos
Una vez evaluado el análisis
microbiológico y viendo que el aceite
esencial de los frutos secos de clavo de olor
actúa sobre Staphylococcus hominis y
Streptococcus pyogenes entre otros, se
consideró realizar una formulación de uso
tópico, específicamente una crema, y evaluar
su efecto sobre una lesión de acné.
Formulada la crema se aplicó sobre la
lesión de acné en un voluntario, con lo que se
comprobó mejora, pues la lesión desapareció
en un periodo de 3 días de aplicación, ya que
disminuyó la inflamación y la presencia de
pus fue desapareciendo gradualmente.
Además, pudo observarse que la forma
farmacéutica formulada al 2 % de aceite
esencial de clavo de olor, resulta beneficiosa
para tratar la patología del acné en las
personas, donde el uso diario de la crema
provocó la eliminación del nódulo.
Se debe destacar que sabiendo de las
propiedades antiinflamatorias,
antimicrobianas y analgésicas se procedió a
evaluar la eficacia de la forma farmacéutica
tópica en otras manifestaciones de la piel que
se encontraron en los voluntarios.